AG Becker

Ehemalige

Leitung: Prof. Dr. Cord-Michael Becker

Die Arbeitsgruppe von Prof. Becker beschäftigt sich mit den molekularen Mechanismen der interzellulären Signaltransduktion und der funktionellen Bedeutung genetischer Heterogenität. Die schnelle synaptische Signaltransmission durch Glycin, Glutamat und GABA wird durch ligandengesteuerte Ionenkanäle und metabotrope Neurotransmitterrezeptoren vermittelt. Funktionsstörungen der inhibitorischen Glycin- und GABA-Rezeptoren führen zu Krämpfen oder hypertonen Bewegungsstörungen. Der Untergang von Nervenzellen nach Schlaganfall, Hirntrauma oder bei chronischen Glaukomen soll demgegenüber auf eine exzessive Aktivierung der erregend wirkenden Glutamatrezeptoren, insbesondere des NMDA-Rezeptors, zurückzuführen sein. An der langsameren purinergen Signaltransduktion durch extrazelluläre Nukleotide sind membrangebundene P2R-Rezeptoren beteiligt, die sich auf die Funktion des vaskulären Systems, die Entzündungsreaktion und das Anpassungs- und Resistenzverhalten von Zellen gegenüber Streßsituationen auswirken. Einen weiteren Interessensschwerpunkt stellt die Analyse genetischer Heterogenität dar, die durch einen neuen methodischen Ansatz mit Hilfe der MALDI-TOF-Massenspektrometrie untersucht wird. Die Arbeitsgruppe Bioinformatik befasst sich insbesondere mit der Untersuchung molekularer Wechselwirkungen durch eine Kombination computergestützter und experimenteller Methoden. Aus dem Bereich der Bioinformatik werden hier vor allem die Sequenzdatenanalyse, die Molekülmodellierung und die Moleküldynamik eingesetzt. Um ein vollständigeres Bild von molekularen Erkennungsvorgängen zu erhalten, werden diese Methoden durch biophysikalische Techniken wie z.B. die Kernresonanz(NMR)-Spektroskopie ergänzt.

Der strychninsensitive Glycinrezeptor, ein ligandengesteuerter Chloridkanal der postsynaptischen Membran, ist ein wichtiger Vermittler synaptischer Inhibition im ZNS. Glycin ist vor allem an der neuronalen Regulation des Muskeltonus durch Zentren in Rückenmark und Hirnstamm beteiligt. Glycinerge Hemmung trägt auch zur Ausbildung des Atemrhythmus in den respiratorischen Zentren des Hirnstamms bei. In extrapyramidal-motorischen Regionen wie dem Caudatum und Putamen sind Glycinrezeptoren ebenfalls an der Vermittlung inhibitorischer Impulse beteiligt, ebenso bei Nociception und entzündlichen Veränderungen des peripheren Nervensystems. An die Symptomatik einer subletalen Strychninvergiftung – das Alkaloid Strychnin ist ein hochaffiner und selektiver Ligand des Glycinrezeptors – erinnern das neurologische Krankheitsbild der Glycinrezeptor-assoziierten Bewegungsstörung Hyperekplexie (Startle-Disease, Stiff-Baby-Syndrome) sowie die Phänotypen von Mausmutanten mit Glycinrezeptordefekten. Die familiäre Form der Hyperekplexie ist durch exzessive Schreckreaktionen (startle reactions) und episodische Muskelsteifheit charakterisiert.

Glycinrezeptoren sind eine Proteinfamilie aus mehreren Isoformen, die aus einzelnen ligandenbindenden α-Untereinheiten (α1-4) und einer strukturellen β-Untereinheit bestehen. Der reife Rezeptor ist ein Proteinkomplex aus fünf Untereinheiten, die den zentralen Ionenkanal umgeben. Die Topologie jeder Untereinheit entspricht dem Bauprinzip der ligandengesteuerten Ionenkanäle vom Typ des nikotinischen Acetylcholinrezeptors: Auf eine N-terminale Domäne, die Determinanten für die Glycin- und Strychninbindung trägt, folgen vier Transmembranregionen (TM 1-4). TM 2 bildet eine α-helikale Sekundärstruktur aus und begrenzt den Anionenkanal. Prominente Oberflächenladungen an den Kanalmündungen dienen als Selektivitätsfilter. Eine große (ca. 90 Aminosäuren) intrazelluläre Schleife zwischen Transmembransegment TM3 und TM4 dient der intrazellulären Modulation der Rezeptorfunktion.

Die topologische Organisation der einzelnen Rezeptoruntereinheit erlaubt es, definierten Domänen bestimmte Teilschritte der Funktion des Glycinrezeptors zuzuordnen. Im Falle der Hyperekplexie zeigen Mutationen – abhängig von der Position des Aminosäureaustauschs – Auswirkungen auf Biogenese, Ligandenbindung, Chloridleitfähigkeit oder Desensitisierungsverhalten des Rezeptorkanals. Die in TM 1 gelegene Mutation α1(S231R) interferiert mit dem Einbau der α1-Untereinheit in die Plasmamembran. In der intrazellulären Schleife zwischen den TM 1 und 2 liegt der Aminosäureaustausch α1(P250T), der zu einer reduzierten Kanalleitfähigkeit und dramatisch beschleunigter Desensitisierung führt. In Zusammenarbeit mit dem Computer Chemie Centrum (CCC, Universität Erlangen-Nürnberg) wird die Konformation dieser Domäne durch Computer-Modelling untersucht. Darüberhinaus zeigte sich, daß die Allelvarianten des Glycinrezeptors unterschiedliche Reaktionen auf Alkohole und Anästhetika aufweisen. Hyperekplexievarianten des Glycinrezeptors, bei denen insbesondere Aminosäuren mit basischer Seitenkette betroffen sind, weisen ein gestörtes Assemblierungsverhalten auf und werden im endoplasmatischen Retikulum zurückgehalten. Zur Heterogenität des Glycinrezeptors tragen nicht nur Untereinheiten- und Allelvarianten, sondern auch Spleißvarianten bei. So konnten wir zwei Spleißvarianten der α3-Untereinheit identifizieren, die sich durch eine Insertion zwischen TM 3 und 4 und ihre Desensitisierungskinetik unterscheiden. Bei der Ontogenese der glycinergen Synapse ist eine Grundaktivität des Rezeptors zur Ausbildung des kompletten synaptischen Apparats erforderlich. Damit erklärt sich die Diskrepanz zwischen beobachtetem Phänotyp einer dominanten Hyperekplexie-Mutation, und deren rezessive Charakteristik im rekombinanten System, die durch eine Koexpressionsstudie aufgeklärt werden konnte. Von der β-Untereinheit des Glycinreceptors sind ebenfalls Spleißvarianten bekannt, denen jeweils ein Exon fehlt und erstmals in Gliazellen identifiziert wurden. Ob diese Spleißvarianten in der Lage sind, zur Kanalfunktion trotz Fehlens eines Exons beizutragen, wird derzeit untersucht. Regulatorische Mechanismen der Glycinrezeptorexpression konnten an neuronal entarteten Zellen des kleinzelligen Lungenkarzinoms aufgeklärt werden. Synthetische Arbeiten legten die Grundlage zur Darstellung und Charakterisierung neuer photoaktivierbarer Glycinrezeptorliganden.

Die neurologischen Mausmutanten spastic, spasmodic und oscillator weisen ebenfalls Glycinrezeptordefekte auf. Die spastische Maus trägt eine Insertionsmutation im Glrb-Gen, wobei ein intronisches LINE-1-Element zu einem Spleißdefekt mit dramatischen Rezeptorverlusten führt. Studien an verschiedenen Mausstämmen zeigen, daß der spastische Phänotyp trotz eines identischen Mutantenallels erheblich variieren kann. Auf welchem Wege der Phänotyp durch Hintergrundgene moduliert wird, ist Gegenstand laufender Studien. Die Mutanten spasmodic und oscillator tragen pathologische Glra1-Allele. Diese Mausstämme stellen ein wichtiges Modell zur Untersuchung der glycinergen Funktion in vivo dar und dienen als Therapiesysteme für den neuronenspezifischen Gentransfer.
Neben Glycinrezeptordefekten konnte auch der molekulare Pathomechanismus einer epileptisch/ataktischen Maus aufgeklärt und auf die Mutation des spannungsgesteuerten Ca2+-Kanals zurückgeführt werden.

Glutamat ist der häufigste exzitatorische Neurotransmitter des zentralen Nervensystems einschließlich der Netzhaut. NMDA-Rezeptoren stellen eine Untergruppe der synaptischen Glutamatrezeptoren dar, deren Untereinheiten drei Genfamilien umfassen. Über die Komplexstruktur der Isoformen dieses wichtigen Rezeptorproteins und deren Expressionsmuster im Nervensystem und der Retina ist noch sehr wenig bekannt. Während der Entwicklung treten altersabhängige Veränderungen der Untereinheitenzusammensetzung des Rezeptorkomplexes auf, die in Gehirn und Retina zu funktionell unterschiedlichen Rezeptorpopulationen führen. Untersuchungen mit Hilfe von Antikörpern gegen synthetische NMDA-Rezeptor-Peptide zeigen, daß der NMDA-Rezeptor als ein oligomerer Komplex mit einem Molekulargewicht von bis zu 690 kDa existiert. Über die Funktion als glutamatgesteuerter Kationenkanal der Synapse hinaus scheint der NMDA-Rezeptor auch an der extraneuralen Signalübertragung beteiligt zu sein. Eine massive Expression der NR2B-Variante des NMDA-Rezeptors fand sich im Myokard der embryonalen Ratte, wo das Rezeptorprotein mit intrazellulären Membranen assoziiert zu sein scheint. Erste Hinweise deuten auf eine möglichliche Beteiligung kardialer NMDA-Rezeptoren an der Calciumregulation des embryonalen Herzmuskels hin.

Als Modell des neuronalen Zelltods dient uns die Induktion des neuronalen Zelluntergangs durch Toxinfraktionen der taiwanesischen Grubenotter Bungarus multicinctus. β-Bungarotoxin bindet sich selektiv an neuronale Zellen und ist ein extrem effizienter Induktor des neuronalen Zelltodes (EC50 < 10-12 M). Nach Bindung von β-Bungarotoxin an spannungsgesteuerte K+ -Kanäle internalisiert dieser Komplex innerhalb weniger Minuten, und löst die charakteristischen Merkmalen des apoptotischen Zelltodes aus. In Zusammenarbeit mit der Gruppe von Prof. A. Konnerth (Institut für Physiologie, Universität München) konnten wir zeigen, dass β-Bungarotoxin einen drastischen und anhaltenden Anstieg des intrazellulären Ca2+ in neuronalen Zellen verursacht. Als entscheidende Signale für den Untergang der geschädigten Neurone konnten wir die durch β-Bungarotoxin induzierte Erhöhung der intrazellulären Ca2+ Konzentration, die Generierung freier Radikale, eine Peroxidation von Lipiden in der neuronalen Zellmembran sowie die Akkumulierung der Phospholipidhydroxyperoxide identifizieren. Dabei gelang es, den apoptotischen Zelltod der geschädigten Nervenzellen durch membrandurchlässige Ca2+-Chelatoren, sowie durch Radikalfänger nahezu vollständig zu blockieren. Die Untersuchung des β-Bungarotoxin-induzierten Zelltodes in primären Hippokampuskulturen hat das Verständnis molekularer Pathomechanismes bei Neurodegeneration deutlich verbessert.

Die Kontamination von Lebensmitteln durch Gewebsanteile des ZNS gilt als Riskofaktor für die Übertragung der spongiformen Neurodegeneration. Daher werden ZNS-spezifische Antikörper und hochsensitive Extraktionsprotokolle generiert, die zur Etablierung eines hochaffinen Immunnachweises zur Detektion von ZNS-Kontaminationen in Lebensmitteln beitragen.

Die Bedeutung molekularer Heterogenitäten auf DNA- und Protein-Nievau in den letzten Jahren ständig gestiegen. Die Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionization Flugzeit (matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight, MALDI-TOF) Massenspektrometrie (MS) stellt eine Methode zur Bestimmung der molekularen Masse von Biomolekülen dar. Durch die hohe molekularen Auflösung, Genauigkeit, Sensitivität, und der prinzipiellen Hochdurchsatzfähigkeit kann MALDI-TOF-MS sinnvoll zur Analyse molekularer Heterogenitäten eingesetzt werden.

Im Bereich der Lebenswissenschaften erlangt die generalisierte Proteinforschung (Proteomics) immer mehr an Bedeutung. Hier wird die Gesamtheit der exprimierten Proteine einer Zelle oder eines Gewebes in Korrelation mit verschiedenen Bedingungen simultan untersucht. Unsere Arbeitsgruppe befasst sich auf diesem Gebiet insbesondere mit der Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen mittels massenspektrometrischer Verfahren. Hierbei wird nach Endoproteinaseverdau des jeweiligen Proteins mit MALDI-TOF-MS ein Peptid-Massenspektrum erstellt („peptide mass fingerprint“). Die Identifizierung erfolgt anschliessend durch Abgleich des generierten Spektrums mit den theoretischen Spektren der in den Datenbanken befindlichen Proteinsequenzen. Nach ähnlichen Verfahren lassen sich auch posttranslationale Modifikationen (Phosphorylierungen, Glycosylierungen, Glykierungen) untersuchen. Dabei kann nicht nur die jeweils modifizierte Aminosäure genau bestimmt werden, sondern mit Hilfe der Auswertung des Signal-Integral-Verhältnisses sogar quantifiziert werden. In jüngster Zeit wurde in Zusammenarbeit mit der Firma Bruker Daltonik in Leipzig ein Verfahren zur chromatografischen Fraktionierung komplexer Proteingemische aus Körperflüssigkeiten an magnetischen Partikeln („Magnetic Beads“) etabliert. Nach Abtrennung einzelner Subfraktionen werden die Proteine direkt auf ein MALDI-TOF-MS-Target eluiert und ihr Massenspektrum erfasst. Durch vergleichende Analyse von Patienten- versus Kontroll-Gruppen sollen so spezifische Biomarker in Körperflüssigkeiten gefunden und direkt identifiziert werden. Eine ähnliche Technik stellt die sog. SELDI-TOF-MS dar, bei der die Proteingemische an chromatografischen Oberflächen eines Chips vorgereinigt werden. Die Analyse erfolgt in der in Zusammenarbeit mit dem Interdisziplinären Zentrums für Klinische Forschung eingerichteten SELDI-TOF-MS-Einheit.

Basierend auf den Daten des Human Genomprojekts rücken genetische Polymorphismen mit klinisch-diagnostischer Relevanz in den Blickpunkt der Forschung. Diese Polymorphismen dienen als Marker zur Identifizierung von krankheitsassozierten Loci und beeinflussen die Anfälligkeit gegenüber zahlreichen Erkrankungen. Die Analyse von Punktmutationen, Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), Indels, Mikrosatelliten-Instabilitäten und „loss of heterozygosity“ stellen somit wichtige Ziele der Molekularen Medizin dar. Unsere Forschungsgruppe entwickelt und optimiert Methoden zur Probenvorbereitung und zur Analyse dieser Heterogenitäten mittels MALDI-TOF-MS. Basierend auf den etablierten Methoden wurden Testsysteme zur Genotypisierung entwickelt und in verschiedenen klinischen Studien angewendet (z.B. Hyperekplexie, Thrombose, Aborte, Tumoren). Durch MALDI-TOF-MS wird untersucht, welche Rolle DNA-Polymorphismen in verschiedenen Genen (z. B. Prionprotein-Gen, Priondoppel-Gen u.a.) bei Rindern hinsichtlich der BSE-Infektion spielen. Hierzu wurde die in Deutschland BSE-positiv getesteten Rinder genotypisiert. Außerdem dient die MALDI-TOF-MS basierte Genotypisierung zusammen mit konventioneller Sequenzierung zur Analyse evolutionärer Zusammenhänge: So untersucht die Arbeitsgruppe beispielhaft das Proteinphosphatase-Gen PPP2R3B, das für eine regulatorische Untereinheit der Proteinphosphatase 2A codiert. Das im telomernahen Bereich der pseudoautosomalen Region der menschlichen Geschlechtschromosomen X und Y lokalisierte Gen zeichnet sich durch eine stark erhöhte Variabilität aus. Derzeit wird deshalb eine vergleichende Analyse des PPP2R3B-Gens mit dem autosomal lokalisierten paralogen Gen PPP2R3A bei verschiedenen Spezies (Primaten, Rind, Schwein, Ratte, Maus) durchgeführt. Um die Bedeutung für die Zellzyklusregulation und die Krebsentstehung zu untersuchen, wurde eine „loss of heterozygositiy“-Untersuchung mit Hilfe bekannter SNPs im PPP2R3B-Gen beim Mamma-Karzinom durchgeführt. Hierbei wurde auch eine Methode zur Analyse von partiellem Allelverlust mit Hilfe der MALDI-TOF-MS entwickelt. Gegenwärtig wird ebenfalls eine Methode zum MALDI-TOF-MS basierten mRNA-Expressionsprofiling entwickelt.